Одним из подходов к лечению мышечной дистрофии Дюшенна (МДД) выступает стратегия пропуска экзона при помощи относительно короткого одноцепочечного фрагмента нуклеиновой кислоты – олигонуклеотида, нацеленного на связывание с определенным участком пре-мРНК дистрофина, с целью восстановления рамки считывания, нарушенной при появлении мутации в гене DMD.
Успех стратегии пропуска экзона и восстановления рамки считывания в каждом конкретном случае требует точного определения положения мутации в гене DMD и подбора наиболее подходящей последовательности олигонуклеотида для коррекции процесса сплайсинга.
Терапия, основанная на пропуске экзона, применима к ~80% мутаций, связанных с делециями в экзонах гена дистрофина, и к ~55% общей суммы мутаций [1].
В таблице 1 приведены номера экзонов, пропуск которых приводит к восстановлению рамки считывания и процент пациентов от общей популяции, которым данный метод может помочь.
Таблица 1
| Экзон | Встречаемость, % |
| 51 | 14 |
| 53 | 10 |
| 45 | 9 |
| 44 | 7.6 |
| 43 | 7.5 |
| 46 | 4.6 |
| 50 | 3.8 |
| 52 | 3.6 |
| 55 | 2.7 |
| 8 | 2.0 |
Данный подход позволяет перевести заболевание МДД в более легкую форму – мышечную дистрофию Беккера, так как биосинтезируемый после коррекции сплайсинга белок представляет собой функциональную, но укороченную форму полноразмерного белка дистрофина.
Следует указать, что генная терапия с использованием вирусного вектора также обеспечивает наработку в организме укороченной версии дистрофина, поскольку ген DMD является самым большим в человеческом геноме. В настоящее время не представляется возможным упаковать полноразмерный ген в имеющиеся вирусные векторы.
Несмотря на то, что генная терапия может выступать универсальной стратегией лечения МДД, не зависящей от вида и положения мутации, применение генной терапии все еще является весьма дорогостоящим. Кроме того, в настоящее время генная терапия еще не достигла того уровня развития, когда ее можно было бы применять рутинно. Неясны в деталях длительность действия вектора, его взаимодействие с иммунной системой и возможность повторной терапии.
В то же время период разработки и применения терапевтических олигонуклеотидов является относительно более длительным по сравнению с генной терапией, что позволило выявить многие «подводные камни» данного способа лечения.
Впервые идея использования олигонуклеотидов, комплементарных участкам мРНК, с целью регуляции экспрессии генов была экспериментально подтверждена в 1978 году Полом Замечником в США [2]. С той поры область применения так называемых антисмысловых (или антисенс-) олигонуклеотидов продолжает активно расширяться. Особый интерес представляют химические модификации, способные улучшить физико-химические и биологические свойств данных соединений, в том числе фармакокинетику и биораспределение в организме человека.
Большинство коммерческих компаний, занимающихся разработкой терапевтических олигонуклеотидов, владеет патентами на какие-либо из химических модификаций и использует именно их при создании своих препаратов. К сожалению, до настоящего времени подобные компании успешно вели работу только за рубежом. Работы российских исследователей [3, 4] до сих пор пока еще не удалось перевести в практическую плоскость, несмотря на показанную перспективность, в то время как российские разработки успешно применяются лидирующими американскими компаниями Ionis Pharmaceuticals и Wave Life Sciences [5, 6].
В настоящее время активно разрабатываются препараты для лечения мышечной дистрофии Дюшенна (МДД) на основе олигонуклеотидов, корректирующих сплайсинг. Лидером выступает компания Sarepta Therapeutics, которая выпустила на фармацевтический рынок США уже три препарата на основе морфолиновых олигонуклеотидов.
Как следует из информации с сайта компании (www.sarepta.com), разработка олигонуклеотидных препаратов ведется наряду с генной терапией, что подтверждает перспективность обоих подходов при лечении МДД.
Кроме Sarepta Therapeutics в США, также существуют японские компании, которые работают над выводом на рынок олигонуклеотидных препаратов для коррекции сплайсинга при МДД, нацеленных на экзоны 53 и 45, а именно, NS Pharma (дочерняя компания Nippon Shinyaku) и Daiichi Sankyo.
Следует отметить, что именно в Японии в 1995 г. была впервые предложена идея коррекции сплайсинга пре-мРНК дистрофина путем пропуска экзона с использованием антисмыслового олигонуклеотида с целью создания терапевтических препаратов для лечения мышечной дистрофии Дюшенна [7].
Первым олигонуклеотидным препаратом, нацеленным на пропуск 51 экзона, предназначенным для лечения наиболее представительной группы больных МДД (14%). (таблица 1), который попытались вывести на фармацевтический рынок, стал дрисаперсен (drisapersen). В состав данного представителя модифицированной РНК длиной 21 нуклеотид входят остатки 2′-О-метилрибозы, соединенные тиофосфатными группами, в которых один из атомов кислорода фосфатной группы заменен на атом серы (рис. 1А). Эти химические модификации содержатся в антисмысловых агентах первого и второго поколений [8]. Дрисаперсен разрабатывался голландской компанией Prosensa Therapeutics BV, позднее вошедшей в состав американской фармацевтической корпорации BioMarin Pharmaceuticals, под торговой маркой Kyndrisa. К сожалению, клинические испытания этого препарата были прекращены в 2016 г. в связи с его недостаточной эффективностью при дозе 6 мг/кг в виде подкожной инъекции, выше которой не позволяла подняться явно выраженная токсичность препарата. В то время как лечение дрисаперсеном, по-видимому, замедляло прогрессирование заболевания у пациентов на ранних стадиях МДД, в Фазе 3 клинических испытаний (NCT01254019) с участием пациентов на ранних и поздних амбулаторных стадиях не наблюдалось полезного эффекта [9].
Рис. 1. Структуры основных производных олигонуклеотидов, используемых при разработке лекарственных препаратов против мышечной дистрофии Дюшенна (МДД): тиофосфат олиго-2′-О-метилрибонуклеотида (А); морфолиновый олигомер (Б); фосфорилгуанидин («PN-химия») (В); ENA (Г). Цветными кружками выделены: атомы серы – оранжевыми, 2′-О-метильные группы – голубыми, диметиламиногруппы – зелеными; морфолиновые кольца выделены красным цветом; фосфорилгуанидиновые группы – синим; этиленовые мостики ENA – фиолетовым; В – азотистое основание: аденин (А), гуанин (G), цитозин (С) или тимин (Т).
Параллельно c дрисаперсеном разрабатывался другой препарат этеплирсен (eteplirsen), также направленный на пропуск экзона 51, но сконструированный на основе третьего поколения антисмысловых агентов, а именно – морфолиновых олигомеров, структура которых отличается от структуры природных нуклеиновых кислот наличием морфолинового кольца вместо рибозного и введением диметиламиногруппы в состав фосфата (рис. 1Б).
Этеплирсен стал первым олигонуклеотидным препаратом, одобренным в США под торговой маркой Эксондис 51 (Exondys 51) для лечения МДД ввиду его низкой токсичности в отличие от дрисаперсена. Хорошо переносимая доза этеплирсена при внутривенной инъекции составляла 30-50 мг/кг. Среди побочных эффектов при проведении клинических испытаний в 38% случаев отмечались нарушение баланса и тошнота, в 25% случаев контактный дерматит. В обсервационных (или наблюдательных) клинических исследованиях наиболее распространенными побочными реакциями, наблюдавшимися в более чем 10% случаев у больных, подвергавшихся лечению этеплирсеном, были головная боль, кашель, сыпь и рвота. Врачи оценивали данные побочные реакции как умеренные.
Однако эффективность этеплирсена не настолько высока, как этого хотелось бы. Согласно тестам по определению уровню дистрофина по методу Вестерн-блот, после 48 недель применения этеплирсена при еженедельном внутривенном введении 30 мг/кг зафиксирован рост уровня белка дистрофина с исходных 0,16% до не более чем 0,44% [10]. По мнению врачей, повышение уровня дистрофина должно соответствовать не менее 10%, чтобы терапия олигонуклеотидами была по-настоящему эффективной [11], хотя на достижение этого показателя оказывают влияние состояние пациента и уровень регресса мышечной ткани. В то же время применение этеплирсена не оказывало отрицательного влияния на печень ни в виде повышения уровня сывороточных ферментов, даже незначительного, ни в виде клинически выраженного повреждения [12].
Нуклеотидные последовательности этеплирсена и дрисаперсена, а также других препаратов для лечения МДД приведены в таблице 2.
Таблица 2
| Препарат | Последовательность нуклеотидов (от 5′ к 3′-концу) |
| Этеплирсен (eteplirsen) | CTC CAA CAT CAA GGA AGA TGG CAT TTC TAG |
| Дрисаперсен (drisapersen) | TCA AGG AAG ATG GCA TTT CT |
| Голодирсен (golodirsen) | GTT GCC TCC GGT TCT GAA GGT GTT C |
| Вилтоларсен (viltolarsen) | CCT CCG GTT CTG AAG GTG TTC |
Еще один препарат для пропуска экзона 51 – суводирсен (suvodirsen), разрабатывавшийся американской компанией Wave Life Sciences – также не обеспечивал увеличения уровня дистрофина у пациентов, что привело к остановке клинических испытаний. Этот олигонуклеотид, аналогично дрисаперсену, относится к тиофосфатным производным РНК с 2′-O-метилированной рибозой (рис. 1А). Разница по сравнению со структурой дрисаперсена заключается в наличии стереорегулярных тиофосфатных связей. Как уже говорилось, почти каждая фармацевтическая компания владеет собственными патентами на какие-либо химические модификации. Компания Wave Life Sciences разрабатывает олигонуклеотидные препараты с использованием запатентованной технологии синтеза стереорегулярных аналогов фосфатной группы. Сначала это были стереорегулярные фосфоротиоаты, которые в случае МДД, как показали клинические испытания суводирсена, не проявили преимуществ по сравнению с «обычными» нестереорегулярными тиофосфатными олигонуклеотидами (такими как дрисаперсен). Однако в 2020 г. компания Wave Life Sciences приобрела лицензию на фосфорилгуанидиновые олигонуклеотиды, впервые полученные в России Стеценко с соавторами (рис. 1В) [4]. В настоящее время компания Wave Life Sciences успешно продолжает испытывать олигонуклеотидные препараты, созданные с применением новой «PN-химии» (так в компании предпочитают обозначать фосфорилгуанидиновые олигонуклеотиды и им подобные соединения). Например, препарат WVE-N531, нацеленный на пропуск экзона 53, с 28 сентября 2021 г. проходит Фазу 1b/2a клинических испытаний (NCT04906460).
При сравнении олигонуклеотидов, подобных WVE-N531, с соединениями первого поколения – тиофосфатами, не содержавшими фосфорилгуанидиновых групп, использование «PN-химии» приводит к повышению эффективности пропуска экзона, что выражается в положительном влиянии на мышцы, и увеличению времени нахождения в организме, как было показано в доклинических исследованиях на мышах [13] и на макаках-крабоедах Macaca fascicularis. Основываясь на анализе исходного PK плазмы после начальной однократной дозы WVE-N531 в текущем клиническом исследовании наблюдалось существенное увеличение концентрации препарата в плазме по сравнению с суводирсеном – представителем первого поколения [14]. Компания Wave Life Sciences настроена оптимистично и надеется на благополучный исход клинических испытаний, которые завершатся в сентябре 2022 г.
Два олигонуклеотида, нацеленные на пропуск экзона 53, а именно голодирсен (golodirsen, торговая марка Vyondys 53) и вилтоларсен (viltolarsen, торговая марка Viltepso) были одобрены для применения в СШA в 2019 и 2020 гг. соответственно (таблица 2). Фаза 3 клинических испытаний вилтоларсена все еще продолжается (NCT04768062, NCT04060199).
Последний на сегодняшний день препарат, одобренный в СШA для лечения МДД – касимерсен (сasimersen, торговая марка Amondys 45), разработанный компанией Sarepta Therapeutics и нацеленный на пропуск экзона 45, также, как этеплирсен, голодирсен и вилтоларсен, представляет собой морфолиновый олигомер (рис. 1Б), который в целом хорошо переносится пациентами.
В настоящее время компания Sarepta Therapeutics разрабатывает морфолиновые олигомеры, нацеленные на пропуск экзонов 43, 44, 50 и 52 [15].
Увеличение экспрессии дистрофина у пациентов было зафиксировано, но не является (по мнению некоторых ученых и клиницистов) максимальным. Одной из возможных причин невысокого уровня повышения дистрофина у пациентов является недостаточно эффективное проникновение морфолиновых олигомеров в мышечные клетки. С целью улучшения данного свойства компания Sarepta Therapeutics изучает присоединение к олигонуклеотиду остатка пептида, который не только облегчит проникновение в клетки, но и, возможно, обеспечит более длительную циркуляцию в плазме крови, что приведет к пролонгированию действия препарата [15]. Конъюгат этеплирсена с пептидом SRP50-51 в данный момент находится в Фазе 2 клинических испытаний (NCT04004065). Кроме компании Sarepta Therapeutics разработкой пептидных конъюгатов морфолиновых олигонуклеотидов также занимается компания PepGen. В начале апреля 2022 года на сайте компании появилась информация, что была запущена 1-ая фаза клинических испытаний для препарата PGN-EDO51, нацеленного также на 51 экзон [16].
Необходимо отметить, что показатели уровня дистрофина определялись в скелетных мышцах. Однако особенно важным является повышение уровня дистрофина в сердечной мышце. Конъюгация олигонуклеотидов с пептидами может усилить выработку дистрофина в сердце, как это было показано в опытах на животных [9].
Таким образом, морфолиновые олигомеры (рис. 1Б) зарекомендовали себя как нетоксичные с возможностью улучшения состояния больных МДД за счет хотя и невысокого, но достоверного увеличения уровня дистрофина в скелетных мышцах после внутривенных инъекций в дозах от 30 до 80 мг/кг.
Японская компания Daiichi Sankyo разрабатывает олигонуклеотидный препарат ренадирсен (renadirsen), представляющий собой 2′-O-метилированную РНК с тиофосфатными связями (рис. 1А), содержащую дополнительно т.н. «замкнутые» нуклеотиды с этиленовыми мостиками (ENA) (рис. 1Г). Согласно данным клинических испытаний, после 48 недель подкожных инъекций олигонуклеотида в дозе от 2 до 6 мг/кг удалось зафиксировать достоверный рост уровня дистрофина в среднем до 0,78%. Кроме того, экспрессия дистрофина в тканях была подтверждена методом иммуногистохимии [17]. Сообщается, что побочные эффекты были умеренными и препарат хорошо переносился всеми восемью пациентами. Особенно хотелось бы отметить обнадеживающий результат опытов на обезьянах, где именно в сердце наблюдался самый высокий процент пропуска экзона 45, что является очень важным показателем. Можно надеяться, что и у пациентов после введения ренадирсена будет улучшаться сердечная деятельность. Авторы продолжают изучать результаты этого исследования, включая влияние на дыхательную и сердечную функцию, а также двигательную функцию у пациентов с МДД.
Используемые и разрабатываемые в настоящее время олигонуклеотидные препараты для лечения МДД просуммированы в таблице 3.
Таблица 3. Олигонуклеотидные препараты, использовавшиеся для лечения мышечной дистрофии Дюшенна (МДД).
| Название | Компания | Химические модификации | Экзон | Применимость | Текущий статус |
| Дрисаперсен (drisapersen, Kyndrisa®) | Prosensa Therapeutics (ныне BioMarin Pharmaceuticals) | Тиофосфат 2′-О-метилированной РНК | 51 | 14% всех пациентов с МДД | Снят с Фазы 3 клинических испытаний |
| Этеплирсен (eteplirsen, Exondys 51®) | Sarepta Therapeutics | Морфолиновый олигомер | 51 | 14% всех пациентов с МДД | Одобрен в СШA с 2016 г. |
| Голодирсен (golodirsen, Vyondys 53®) | Sarepta Therapeutics | Морфолиновый олигомер | 53 | 8% всех пациентов с МДД | Одобрен в СШA с 2019 г. |
| Вилтоларсен (viltolarsen, Viltepso®) | Nippon Shinyaku (NS Pharma) | Морфолиновый олигомер | 53 | 8% всех пациентов с МДД | Одобрен в СШA с 2020 г. |
| Касимерсен (casimersen, Amondys®) | Sarepta Therapeutics | Морфолиновый олигомер | 45 | 9% всех пациентов с МДД | Одобрен в СШA с 2021 г. |
| Ренадирсен (renadirsen) | Daiichi Sankyo | Тиофосфат 2′-О-метилированной РНК c ENA вставками | 45 | 9% всех пациентов с МДД | Проходит Фазу 2 клинических испытаний (NCT04433234) |
| SRP50-51 | Sarepta Therapeutics | Морфолиновый олигомер с пептидом | 51 | 14% всех пациентов с МДД | Проходит Фазу 2 клинических испытаний (NCT04004065) |
| WVE-N531 | Wave Life Sciences | 2′-О-метилированная / 2′-F РНК со стереорегуляр-ными PS/PN связями | 53 | 8% всех пациентов с МДД | Проходит Фазу 1b/2a клинических испытаний (NCT04906460) |
Завершая этот мини-обзор, можно сделать вывод, что конструирование олигонуклеотидов, нацеленных на пропуск экзонов при МДД, сохраняет свою актуальность, поскольку данные препараты оказывают терапевтическое действие, эффективность которого варьирует в зависимости от возраста пациентов, типа мутации и степени прогресса мышечной дистрофии. Следует также указать, что критериями эффективности препарата часто признаются только двигательные тесты, например, тест на расстояние, которое проходит пациент в течение шести минут (six minutes walking test, 6MWТ), и восстановление уровня дистрофина в скелетных мышцах. Это достаточно косвенные методы и только долговременное использование препаратов с длительным наблюдением за пациентами (функциональностью всех органов, вовлеченных в дистрофический процесс по причине заболевания) в разных условиях поможет оценить, насколько данные препараты являются эффективными при лечении МДД.
Путем введения различных химических модификаций, а также изменения последовательность олигонуклеотида, нацеленного на пропуск того или иного экзона, можно существенно улучшить терапевтические свойства препарата. Подобрав эффективное сочетание химических модификаций и оптимизировав последовательность олигонуклеотида, чтобы он специфично и с высокой аффинностью мог связываться с РНК-мишенью, можно создавать лекарственные препараты для персонализированной медицины.
Так, в мировой практике известен пример создания олигонуклеотидного препарата для одного конкретного пациента с редкой генетической болезнью всего за 10 месяцев от выявления мутации до получения разрешения на применение препарата [18]. В случае мышечной дистрофии Дюшенна, как показывает практика, при большинстве мутаций в гене DMD, если они не находятся в функциональной области белка, можно подобрать эффективную последовательность олигонуклеотида для коррекции сплайсинга.
Список литературы
- Catherine L Bladen, David Salgado, Soledad Monges, Maria E Foncuberta et al. The TREAT-NMD DMD Global Database: analysis of more than 7,000 Duchenne muscular dystrophy mutations. Hum Mutat. 2015. 36(4):395-402. doi: 10.1002/humu.22758.
- Stephenson M.L., Zamecnik P.C. Inhibition of Rous sarcoma virus replication and cell transformation by a specific oligodeoxynucleotide. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1978;75:280–284. doi: 10.1073/pnas.75.1.285.
- Патент RU2740501C2. МОДИФИЦИРОВАННЫЕ ОЛИГОНУКЛЕОТИДЫ, АКТИВИРУЮЩИЕ РНКазу Н. Стеценко Дмитрий Александрович, Челобанов Борис Павлович, Фокина Алеся Анатольевна, Буракова Екатерина Анатольевна.
- Kupryushkin M S, Pyshnyi D V, Stetsenko D A. Phosphoryl guanidines: a new type of nucleic Acid analogues. Acta Naturae. 2014. 6(4):116-8.
- Anderson B A, Freestone G C, Low A, De-Hoyos C L, Iii WJD et al. Towards next generation antisense oligonucleotides: mesylphosphoramidate modification improves therapeutic index and duration of effect of gapmer antisense oligonucleotides. Nucleic Acids Res. 2021. 49(16):9026-9041. doi: 10.1093/nar/gkab718.
- Kandasamy P, Liu Y, Aduda V, Akare S et al. Impact of guanidine-containing backbone linkages on stereopure antisense oligonucleotides in the CNS. Nucleic Acids Res. 2022 doi: 10.1093/nar/gkac037. Online ahead of print.
- Masafumi Matsuo. Antisense Oligonucleotide-Mediated Exon-skipping Therapies: Precision Medicine Spreading from Duchenne Muscular Dystrophy. JMA J. 2021. 15;4(3):232-240. doi: 10.31662/jmaj.2021-0019.
- Kurreck J. Antisense technologies. Improvement through novel chemical modifications. Eur J Biochem. 2003. 270(8):1628-44. doi: 10.1046/j.1432-1033.2003.03555.x.
- Schneider AE, Aartsma-Rus A. Developments in reading frame restoring therapy approaches for Duchenne muscular dystrophy. Expert Opin Biol Ther. 2021. 21(3):343-359. doi: 10.1080/14712598.2021.1832462.
- Ссылка на интернет ресурс EXONDYS 51 (eteplirsen) injection for Healthcare Professionals (exondys51hcp.com)
- Ссылка на интернет ресурс «Эксондис 51»: лекарство против мышечной дистрофии Дюшенна | МОСМЕДПРЕПАРАТЫ (mosmedpreparaty.ru)
- Ссылка на интернет ресурс Eteplirsen — LiverTox — NCBI Bookshelf (nih.gov)
- Kandasamy P, McClorey G, Shimizu M, Kothari N et al. Nucleic Acids Res. 2022. 21; doi: 10.1093/nar/gkac018. Online ahead of print.
- Ссылка на интернет ресурс Wave Life Sciences Reports Fourth Quarter and Full Year (globenewswire.com)
- Ссылка на интернет ресурс Our Pipeline | Sarepta Therapeutics
- Ссылка на интернет ресурс News & Publications | PepGen
- Ссылка на интернет ресурс Poster Session — Parent Project Muscular Dystrophy (parentprojectmd.org)
- Ссылка на интернет ресурс https://cen.acs.org/business/Milasen-drug-idea-injection-10/97/i42
